GPM.1.2.4.0006.15 Bacterial endotoxins

Исключительное значение в понимании механизмов развития инфекционных заболеваний сыграло открытие бактериальных токсинов. Удивительно интересную страницу в изучении инфекционных болезней составляют исследования, посвященные, в частности, бактериальным липополисахаридам (эндотоксинам), которая, судя по всему, окончательно не дописана до сих пор.

ⓘ Эндотоксины

Эндотоксины — бактериальные токсические вещества, которые представляют собой структурные компоненты определённых бактерий и высвобождаются только при лизисе бактериальной клетки. Это отличает эндотоксины от экзотоксинов, растворимых соединений, секретируемых живой бактериальной клеткой.

Основным примером эндотоксинов является липополисахарид или липоолигосахарид. Липополисахарид грам-отрицательных бактерий настолько глубоко исследован и настолько широко применяется как эндотоксин, что часто термины эндотоксин и липополисахарид используются как синонимы.

Эндотоксин — это фактор патогенности грамотрицательной бактерии, содержащийся в ее стенке.

Клеточная стенка бактерий, как грамотрицательных, так и грамположительных  имеет плазматическую мембрану и слой пептидогликана . Слой пептидогликана состоит из углеводной и пептидной цепи и  добавляет структурную прочность  клеточной стенке. Грамотрицательные бактерии отличаются тем, что их пептидогликановый слой  намного тоньше, чем у грамположительных бактерий, но за то, у них есть внешняя оболочка, покрывающая его.

Эта наружная мембрана содержит слой липополисахарида (LPS). В пределах липидной части этого слоя  находится липид А, который является опасным эндотоксином. Антибиотики, проникая в эту наружную мембрану, делают грамотрицательные бактерии устойчивыми.

Грамотрицательные бактерии выделяют опасные эндотоксины прежде всего, когда их убивают. Это может произойти, когда иммунная система или антибиотики атакуют бактерии и разрушают их клеточные стенки. Когда стенки клеток разрушаются, фрагменты наружной мембраны высвобождаются, включая эндотоксины. Чрезмерная выработка эндоксинов стимулирует развитие местной воспалительной реакции, с повреждением эндотелия кишки и нарушением кишечного барьера.

Читайте также:  Как предупредить и вылечить экзему на голове

Эндотоксин  пересекает нарушенный кишечный барьер пара целлюлярно ( между клетками)  или может поглощаться энтероцитами,  повреждая  липопротеины их мембран. Его обнаружение в крови имеет важную диагностическую значимость   в отношении гипотезы leaky gut при различных заболеваниях.

Существуют также другие маркеры микробного проникновения в кровь, такие как  пептидогликаны микробной стенки, флагеллин, определяющий антигенную специфичность бактерии, липотейхоевая кислота, содержащаяся в клеточной стенке бактерий,   (1 → 3) -β-D-глюкан – содержащийся в клетках дрожжевой инфекции.

В качестве  передатчиков  информации о микробах и повреждении тканей в организме человека работают  Toll-подобные рецепторы (TLR).

Toll-подобные рецепторы — это семейство молекул, распознающих консервативные патоген-ассоциированные паттерны микробных структур (PAMP – Pathogen- associated Molecular pattern), то есть проще говоря различающие молекулы патогенных микробов. В этом качестве они абсолютно необходимы для определения стратегий защиты организма-хозяина от микробных патогенов. Кроме того, Toll-подобные рецепторы играют важную роль в поддержании тканевого гомеостаза , например при заживлении поврежденных тканей. Судя по всему, TLR делают это путем распознавания микробов и эндогенных сигналов апоптоза (клеточной смерти) и повреждения тканей.

  Анализ Toll-подобных рецепторов указывает, что несколько микробных продуцентов  действуют одновременно как патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMPs), иными словами – молекулы патогенных бактерий,  при прогрессировании различных заболеваний.

Микробные продуценты попадают из просвета кишечника в кровоток через нарушенные межклеточные соединения. Они реагируют на toll-подобные рецепторы (TLR) в макрофагах, лимфоцитах и ​​других клетках  и индуцируют воспаление в различных тканях. Каждый TLR обнаруживает  свою специфическую патоген-ассоциированную молекулярную структуру (PAMP), что отражено на схеме ниже.

Уровни  PAMPs – молекул патогенных микробов   в крови увеличиваются в различных клинических ситуациях. Эндотоксин является самым значимым циркулирующим маркером, отражающим микробную транслокацию в кишечнике. Его обнаружение методологически определено методом ГХМС ( по Осипову Г.А.)

Читайте также:  Инфекционный ринотрахеит у кошек. Симптомы и лечение

 Другие микробные продуценты находятся в стадии изучения и пока не могут рассматриваться,  как универсальные медиаторы воспаления в крови. Хотя их взаимосвязь с кишечной проницаемостью и про воспалительными цитокинами и хемокинами, очевидна.

На рисунке представлена схема:

Кишечная дисфункция, основные микробные транслокационные маркеры в крови и последующие воспалительные изменения в органах-мишенях.

Что такое эндотоксины?

Эндотоксины представляют собой липополисахариды, вырабатываемые грамотрицательными бактериями. Эндотоксины связаны клетками и производятся только тогда, когда лизис клеток. Энтотоксины присутствуют во внешней оболочке клеточной стенки в грамм-бактериях. Эндотоксины также называют липополисахаридами и присутствуют в клетках E coli, Shigella, Salmonella, Pseudomonas, Haemophilus influenza, Neisseria и Vibrio cholerae. Эндотоксины обычно секретируются путем развития бактерий из-за действий определенных антибиотиков или при действии фагоцитарного пищеварения.

Эндотоксины проявляют меньшую активность и не очень активны на их субстрате. Они обладают теплостойкостью. Наружная стенка бактерий непроницаема для больших молекул и молекул, которые не могут растворяться в воде и защищаться от внешней среды.

Эти токсины являются частью этой защитной деятельности. Он действует на хосте во время колонизации. Кроме того, эндотоксины проявляют слабую антигенность.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (Метод В)

Этим методом определяют содержание бактериальных эндотоксинов с помощью ряда последовательных разведений испытуемого лекарственного средства.

Процедура испытания

Для проведения анализа готовят Растворы A – D по схеме, приведенной в Таблице 4.

Растворы А – разведения испытуемого лекарственного средства, начиная с того разведения, в котором отсутствуют мешающие факторы, до наибольшего разведения, не превышающего МДР.

Раствор В – наименьшее разведение из серии разведений раствора А, к которому добавлен раствор КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 (положительный контроль испытуемого образца).

Читайте также:  Баня при ОРВИ и коронавирусе COVID 19 в 2020

Растворы С – серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (положительный контроль).

Раствор D – вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Анализ проводят, как описано в разделе «Процедура анализа» .

Таблица 4 — Схема эксперимента «Количественный анализ»

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (Метод В)

Результаты и интерпретация

Анализ считают достоверным, если:

– для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в двух повторностях,

– для растворов С (положительный контроль) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5и не более 2.

– для раствора В (положительный контроль испытуемого образца) получены положительные результаты в двух повторностях,

Для растворов А конечной точкой реакции является положительный результат, полученный для наибольшего разведения испытуемого лекарственного средства.

Значение произведения фактора этого разведения на величину чувствительности ЛАЛ-реактива (l) равно концентрации эндотоксина в растворе А , полученной для данной повторности. Среднее геометрическое значение концентрации эндотоксина рассчитывают, как описано в разделе «Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива» .

Если во всех повторностях серии растворов А получены отрицательные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве меньше величины произведения чувствительности ЛАЛ-реактива и наименьшего фактора разведения. Если во всех повторностях серии растворов А получены положительные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве больше величины произведения чувствительности ЛАЛ-реактива и наибольшего фактора разведения.

Лекарственное средство считают выдержавшим испытание, если определенное в эксперименте среднее значение содержания бактериальных эндотоксинов менее значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье.